Copia recettori toll-like e tumorigenesi. E anche nella sezione “Recettori toll-like. Il loro significato

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Introduzione

I recettori toll-like (TLR) sono i componenti principali del sistema immunitario innato, che mediano il riconoscimento specifico di modelli molecolari di agenti patogeni conservati evolutivamente (PAMP - modelli molecolari associati ai patogeni). I recettori toll-like sono presenti su cellule di vario tipo, da quelle epiteliali a quelle immunocompetenti. Come è noto, quando il TLR si lega ai propri ligandi, vengono attivate numerose proteine ​​adattatrici e chinasi, che sono coinvolte nell'induzione di fattori proinfiammatori chiave. Il risultato di tale induzione è lo sviluppo sia di una risposta immunitaria innata come risultato dell'aumentata espressione di numerose proteine ​​anti-apoptotiche, citochine proinfiammatorie, proteine ​​antibatteriche, sia di una risposta immunitaria acquisita attraverso la maturazione delle cellule dendritiche, antigene presentazione, ecc.

Grazie alla loro capacità di potenziare le risposte immunitarie specifiche e non specifiche dell'organismo, gli agonisti dei recettori Toll-like hanno trovato applicazione non solo nella terapia malattie infettive, ma anche come coadiuvanti nella chemioterapia di diverse neoplasie maligne. Tuttavia, fino ad oggi, fondamentalmente descritto vari effetti TLR sui tumori. Da un lato, è stato dimostrato che i TLR (e i loro ligandi) possono agire come soppressori della crescita tumorale, dall’altro i TLR possono stimolare la progressione del tumore e influenzare la resistenza dei tumori alla chemioterapia; Questa recensione riassume i dati sull'effetto dei TLR e dei loro agonisti sulla crescita del tumore e analizza anche i principali meccanismi alla base di tali differenze.

Elenco delle abbreviazioni TLR - Recettori Toll-like; LPS - lipopolisaccaride; NF-kB - fattore di trascrizione nucleare kB; PRR - recettori per il riconoscimento di pattern; PAMP: modelli molecolari associati ai patogeni; DAMP: modelli molecolari associati al danno; IRF - fattore regolatore dell'interferone, dsRNA - acido ribonucleico a singolo e doppio filamento; TNF-b - fattore di necrosi tumorale b; IL - interleuchina; IFN - interferone; Cellule NK - cellule killer naturali; siRNA - piccolo RNA interferente; TGF - fattore di crescita trasformante.

1. Storia della scoperta

patogeno antitumorale immunitario del recettore

Nel 1985, mentre studiava varie mutazioni nel moscerino della frutta, la famosa biologa tedesca Christiane Nüsslein-Volhard scoprì larve mutanti con una parte ventrale del corpo sottosviluppata. La sua risposta immediata è stata "Das war ja toll!" ("Questa è classe!"). L'epiteto toll (cool) fu successivamente dato al gene corrispondente come nome.

Nel 1996 si è scoperto che questo gene è responsabile non solo della polarizzazione dorsoventrale durante lo sviluppo embrionale, ma anche della resistenza della Drosophila alle infezioni fungine. Questa scoperta dello scienziato francese Jules Hoffmann è stata insignita del Premio Nobel 2011. Nel 1997, Ruslan Medzhitov e Charles Janeway dell'Università di Yale scoprirono un gene omologo simile a un pedaggio nei mammiferi (ora chiamato TLR4). Si è scoperto che TLR4 provoca l'attivazione del fattore nucleare kappa B NF-κB allo stesso modo dell'interleuchina-1. Infine, nel 1998, si scoprì che il ligando del recettore era un componente della parete cellulare dei batteri gram-negativi, il lipopolisaccaride.

2. TLR del sistema immunitario

2.1 Struttura TLR

In base alla loro organizzazione strutturale, i TLR appartengono alla famiglia dei recettori IL-1 (IL-1R). I TLR sono proteine ​​transmembrana espresse sulla superficie cellulare e nei compartimenti subcellulari (come gli endosomi). La localizzazione del TLR è legata al tipo di ligando che riconosce. Pertanto, i TLR 1, 2, 4, 5, 6, che legano i componenti strutturali batterici, sono localizzati sulla superficie cellulare, mentre i TLR 3, 7, 8, 9, che riconoscono prevalentemente strutture associate al virus - acidi nucleici (dsRNA, ssRNA , DNA), si trovano negli endosomi, dove interagiscono con i ligandi dopo la deproteinizzazione dei virioni.

La struttura TLR include un dominio N-terminale ricco di leucina (LRR) responsabile del legame del ligando, un dominio transmembrana e un dominio di segnalazione intracellulare C-terminale (omologo al dominio intracellulare di IL-1R).

I TLR sono espressi nella maggior parte dei tipi cellulari del corpo umano, comprese le cellule epiteliali ed endoteliali non emopoietiche. Il numero di TLR espressi simultaneamente e la loro combinazione sono specifici per ciascun tipo di cellula, e soprattutto i TLR si trovano in cellule di origine ematopoietica, come macrofagi, neutrofili, cellule dendritiche

Attualmente sono stati identificati 13 diversi TLR nei mammiferi, 10 negli esseri umani e 12 nei topi. I TLR da 1 a 9 sono conservati tra uomo e topo. Tuttavia, ci sono anche delle differenze. Il gene che codifica per TLR10 si trova solo negli esseri umani, mentre TLR11 si trova in entrambe le specie ma è funzionale solo nei topi.

La caratteristica principale dei TLR, che li distingue dai recettori immunitari acquisiti (recettori delle cellule T e B), è la loro capacità di riconoscere non epitopi unici, ma strutture molecolari associate ai patogeni (PAMP) conservate evolutivamente, ampiamente rappresentate in tutte le classi di microrganismi e virus, indipendentemente dalla loro patogenicità. La specificità del riconoscimento PAMP è stata studiata abbastanza bene per la maggior parte dei TLR oggi sono noti i ligandi TLR 1-9 e 11 (Fig. 1); Il ruolo biologico e la specificità di TLR10 (umano), 12 e 13 (topo) rimangono sconosciuti.

I ligandi TLR microbici più conosciuti sono:

lipopeptidi batterici, acido lipoteicoico e peptidoglicani; lipoarabidomannano micobatterico; zymosan, componente della parete cellulare fungina, che si lega a TLR2, che forma eterodimeri con TLR1, TLR6 e CD14;

LPS da batteri gram-negativi, ligando TLR4;

un componente del flagello batterico - flagellina, che attiva TLR5; strutture simili alla profillina di protozoi che si legano a TLR11;

DNA (sequenze CpG non metilate) riconosciuto da TLR9;

dsRNA - ligando TLR3;

Gli ssRNA sono ligandi per TLR7 e TLR8.

Recentemente è stato dimostrato che i TLR possono essere attivati ​​da molte molecole endogene - allarmine (acido ialuronico, proteine ​​da shock termico, ecc.), che compaiono durante la distruzione dei tessuti. Questi composti, eterogenei per natura e struttura (PAMP e allarmine), riconosciuti dai TLR, sono attualmente combinati in un'unica famiglia chiamata DAMP (modelli molecolari associati al danno)

2.2 Interazione dei TLR con i self-ligandi

Ora, dalla descrizione della struttura e delle funzioni dei TLR, passiamo agli eventi che si svolgono dopo che si legano ai propri ligandi.

Il legame del ligando a un TLR avvia una cascata di segnali originati dai domini TIR citoplasmatici del TLR. Il segnale dal dominio TIR attraverso le molecole adattatrici MyD88 (fattore di differenziazione mieloide 88), TIRAP (adattatori contenenti dominio TIR), TICAM1 (TRIF), TICAM2 (molecola adattatrice contenente TIR) viene trasmesso alle corrispondenti chinasi (TAK, IKK , TBK, MAPK, JNKs, p38, ERK, Akt, ecc.), che attivano differenzialmente fattori di trascrizione (NF-kB, AP-1 e IRF) responsabili dell'espressione di vari fattori proinfiammatori e antimicrobici. Inoltre, tutti i TLR, eccetto TLR3, trasmettono un segnale alle chinasi utilizzando MyD88. Segnali TLR3 tramite TICAM1 e TLR4 tramite MyD88 e TICAM1.

L'attivazione di un particolare fattore è determinata dal tipo di TLR da cui viene trasmesso il segnale. Pertanto, quasi tutti i TLR (TLR2 e i suoi co-recettori - TLR1 e TLR6, nonché TLR4-9, TLR11), legandosi ai propri ligandi, sono in grado di attivare NF-kB, uno dei principali fattori che regolano l'espressione di citochine proinfiammatorie come IL-1, -6, -8, ecc. L'attivazione di un'altra famiglia di fattori di trascrizione proinfiammatoria, IRF, è causata dalla trasmissione del segnale attraverso TLR3, 4, 7-9. I segnali trasmessi attraverso TLR3 o TLR4 portano all'attivazione di IRF3, che regola l'espressione di IFN-β ed è considerato un componente critico delle risposte immunitarie antivirali. La segnalazione attraverso TLR7-9 porta all'attivazione di IRF5 e IRF7 e all'espressione di IFN-β, che svolge anche un ruolo vitale nella difesa antivirale. La segnalazione tramite TLR2 o TLR5 non porta all'attivazione dei fattori della famiglia IRF.

Pertanto, l'interazione di un certo tipo di TLR con il proprio ligando avvia una cascata di segnali che porta all'attivazione dell'espressione di una specifica combinazione di geni (citochine, molecole antimicrobiche, ecc.). Tuttavia, al momento, molto sull’attivazione delle vie di segnalazione dipendenti dai TLR e sullo sviluppo degli effetti conseguenti rimane poco chiaro. La letteratura scientifica disponibile manca di dati che caratterizzino i cambiamenti trascrittomici e proteomici completi che si verificano in risposta all'attivazione di TLR specifici.

3. Funzioni TLR

In base alle funzioni che svolgono nell'organismo, i TLR appartengono alla famiglia dei PRR, che mediano il riconoscimento specifico di strutture evolutivamente conservate dei patogeni (PAMP - modelli molecolari associati ai patogeni). Legandosi al PAMP, i TLR attivano il sistema immunitario innato e determinano in gran parte lo sviluppo dell'immunità adattativa. Il ruolo più conservativo del TLR è l'attivazione dell'immunità antimicrobica nella pelle, nelle mucose dei tratti respiratorio, gastrointestinale e urogenitale.

I TLR riconoscono le molecole microbiche, il che porta allo sviluppo di reazioni infiammatorie causate dall'attivazione del fattore NF-kB, che regola l'espressione delle citochine proinfiammatorie (TNF-b, IL-1, IL-6, ecc.) e chemochine (MCP-1, MCP-3, GMCSF, ecc.).

I TLR sono coinvolti nella regolazione trascrizionale e post-traduzionale (scissione e secrezione proteolitica) di fattori antimicrobici come le defensine (b e c), la fosfolipasi A2, il lisozima, ecc. I TLR migliorano l'assorbimento dei microrganismi da parte dei fagociti e ottimizzano la loro inattivazione regolando il rilascio di radicali perossidici e ossido nitrico.

È noto che i TLR situati sulla superficie delle cellule endoteliali assicurano indirettamente la migrazione dei leucociti nel sito dell'infiammazione, stimolando l'espressione delle molecole di adesione dei leucociti: E-selectina e ICAM-1.

La stimolazione dei TLR porta direttamente ad un aumento della produzione di interferoni (IFN)-b sia da parte delle cellule stromali che ematopoietiche, che è importante per proteggere il corpo dalle infezioni virali e da alcune infezioni batteriche. Inoltre, è stato recentemente scoperto che i TLR, attivando una serie di molecole (FADD, caspasi 8, proteina chinasi R (PKR)) o stimolando l'espressione di IFN-b/v, possono indurre lo sviluppo dell'apoptosi, un importante meccanismo che protegge le cellule dai microrganismi patogeni.

È stato dimostrato che i TLR svolgono un ruolo centrale nella regolazione della risposta immunitaria adattativa. Pertanto, l'attivazione TLR-dipendente delle cellule dendritiche professionali presentanti l'antigene è un fattore determinante in diversi processi fondamentali per lo sviluppo dell'immunità adattativa: attivazione delle cellule T mature; elaborazione e presentazione di antigeni microbici; aumentata espressione di molecole costimolatorie (CD80, CD86), necessarie per l'attivazione delle cellule T CD4+ naive; soppressione delle cellule T regolatorie attraverso la produzione di IL-6. È noto anche che l'attivazione TLR-dipendente è importante per la proliferazione e la maturazione delle cellule B durante l'infezione.

Pertanto, i TLR svolgono un ruolo importante nel corpo, che è lo sviluppo di reazioni infiammatorie (attivazione dell'immunità innata) in risposta all'ingresso di una varietà di agenti patogeni nel corpo (protozoi, funghi, batteri, virus). Inoltre, secondo i concetti moderni, il riconoscimento degli agenti patogeni tramite i TLR è un punto chiave nella formazione della seconda linea di difesa: l'immunità adattativa. È stato inoltre dimostrato che i TLR partecipano al normale funzionamento dell'intestino, sono coinvolti nello sviluppo di malattie autoimmuni (lupus sistemico), artrite, aterosclerosi, ecc. Recentemente sono stati ottenuti dati che dimostrano che i TLR sono in grado di; attivare l’immunità antitumorale o, al contrario, stimolare la progressione del tumore.

3.1 Attività antitumorale dei TLR

Molti agonisti dei TLR sono attualmente in sperimentazione clinica come agenti antitumorali. Pertanto, gli agonisti naturali (ssRNA) e sintetici (imiquimod) di TLR7 e 8 hanno mostrato un'elevata attività contro la leucemia linfocitica cronica e i tumori della pelle. Il ligando TLR9 è CpG, capace di sopprimere la crescita di linfomi, tumori del cervello, dei reni e della pelle. E il ligando TLR3 - poli(IC) ha un effetto pro-apoptotico non solo contro le cellule tumorali, ma anche contro le cellule circostanti (ad esempio l'endotelio).

È stato dimostrato che gli agonisti TLR4 - LPS di batteri gram-negativi e OK-432 (un farmaco degli streptococchi di gruppo A) hanno un'elevata attività antitumorale se somministrati per via intratumorale. Tuttavia, se somministrati per via sistemica, entrambi i farmaci (LPS e OK432) non avevano la capacità di bloccare la crescita del tumore. Attualmente, il farmaco OK-432 è sottoposto alla seconda fase di studi clinici come trattamento contro i tumori del colon-retto e del cancro ai polmoni. È stato inoltre dimostrato che l'OM-174, un agonista chimico di TLR2/4, è in grado di sopprimere la progressione del melanoma e aumentare la sopravvivenza degli animali da esperimento quando co-somministrato con ciclofosfamide. Questi esperimenti hanno rivelato che gli agonisti TLR2/4 inducono la secrezione di TNF-β e l'espressione di NO sintasi inducibile. Come è noto, l'NO è in grado di indurre l'apoptosi nelle cellule tumorali resistenti alla chemioterapia, aumentando così l'aspettativa di vita dei topi. Un altro noto farmaco antitumorale di origine microbica che attiva reazioni TLR-dipendenti (TLR2, 4, 9) è il BCG. Questo farmaco è stato utilizzato con relativo successo nel trattamento dei tumori della vescica da oltre 30 anni.

In generale, va notato che diversi agonisti dei TLR sono attualmente in fase di sperimentazione in studi clinici contro tumori di varia origine.

Uno dei principali meccanismi di attività antitumorale dei TLR è la loro capacità di stimolare lo sviluppo di una risposta immunitaria tumore-specifica. Pertanto, l'attivazione TLR:

1) stimola (direttamente o indirettamente) la migrazione nel tumore delle cellule NK, delle cellule T citotossiche e delle cellule T helper di tipo IT, che provocano la lisi delle cellule tumorali utilizzando vari meccanismi effettori (secrezione di perforine, granzimi, IFN-g, ecc.) ;

2) porta alla secrezione dell'IFN di tipo I (IFN-b, c). Un altro probabile meccanismo per l'attività antitumorale dei TLR è la possibilità di una transizione TLR-dipendente del tipo di macrofagi che stimolano il tumore (M2) al tipo di soppressore del tumore M1. I macrofagi M2 sono caratterizzati dall'espressione di citochine come TGF-β e IL-10, componenti necessari per la riparazione e il rimodellamento dei tessuti. Il TGF-b stimola la proliferazione delle cellule tumorali, l'IL-10 dirige lo sviluppo della risposta immunitaria verso Th2, bloccando così lo sviluppo dell'immunità antitumorale cellulare. I macrofagi di tipo M1, al contrario, esprimono IL-1, -6, -12, TNF-b, IFN-ge stimolano lo sviluppo di una risposta immunitaria cellulare antitumorale (Th1).

3.2 Attività di promozione del tumore dei TLR

Come è noto, le infezioni croniche e l'infiammazione sono i fattori più importanti che stimolano lo sviluppo di neoplasie maligne. In particolare, il cancro gastrico può essere associato a un’infiammazione cronica causata da un agente patogeno come l’Helicobacter pylori, e l’infiammazione cronica del tratto digestivo è spesso associata allo sviluppo del cancro del colon. Inoltre, è stato dimostrato che l’uso di farmaci antinfiammatori non steroidei può ridurre il rischio di sviluppare alcuni tipi di tumori maligni.

I TLR fungono da collegamento chiave nel sistema immunitario innato dell'uomo e degli animali e sono coinvolti nello sviluppo di reazioni infiammatorie quando le cellule entrano in contatto con vari agenti patogeni; Il ruolo dei TLR nello sviluppo e nella progressione di tumori di varia origine è attualmente oggetto di studio attivo. I TLR possono essere coinvolti nello sviluppo e nella promozione della tumorigenesi attraverso diversi meccanismi.

Uno dei fattori più importanti che determinano la relazione tra infiammazione cronica e formazione di tumori è NF-kB. Questo fattore è costitutivamente attivato in oltre il 90% dei tumori umani, tra cui la leucemia mieloide acuta e cronica, il cancro alla prostata, il mieloma multiplo, l'epatoma maligno (cancro al fegato), ecc.

A questo proposito, gli agenti capaci di attivare NF-kB potrebbero essere direttamente coinvolti nello sviluppo e nella progressione del tumore. Come è noto, l'interazione dei patogeni con i TLR sulla superficie cellulare porta all'attivazione di NF-kB e all'espressione di geni NF-kB-dipendenti, che determina la partecipazione dei TLR alla stimolazione della carcinogenesi. L'attivazione di NF-kB porta ad un aumento della produzione di citochine IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, TNF-b; migrazione delle cellule del sistema immunitario nel sito dell'infiammazione a seguito dell'aumento della produzione di chemochine; “mantenere” l’infiammazione cronica; aumentare la produzione di fattori anti-apoptotici, ecc. Queste proprietà possono garantire la sopravvivenza e la progressione del tumore sopprimendo l’apoptosi e la citotossicità, nonché inducendo l’angiogenesi.

È ormai noto che il livello di TLR è aumentato nelle cellule di vari tumori e nei topi con eliminazione dei geni TLR la frequenza di formazione di tumori inducibili è ridotta. Inoltre, l’aumento dell’espressione dei TLR sulla superficie della prostata o delle cellule tumorali della testa e del collo può stimolarne la proliferazione.

Huang et al. hanno dimostrato che Listeria monocytogenes ha effetti diretti di promozione del tumore associati alla sua capacità di attivare vie di segnalazione dipendenti da TLR2 nelle cellule tumorali ovariche. Inoltre, l'attivazione TLR2-dipendente di NF-kB causata da L. monocytogenes ha portato ad un aumento della resistenza delle cellule tumorali ai farmaci chemioterapici.

La relazione tra TLR2 e progressione del tumore è stata confermata in un altro studio indipendente in cui Karin et al. hanno dimostrato il ruolo chiave di questo recettore nella metastasi del cancro del polmone. Si è scoperto che nei topi con il gene TLR2 eliminato, la metastasi e la progressione dei tumori avvengono molto più lentamente rispetto ai topi selvatici. Un ruolo chiave nella progressione del cancro del polmone è stato svolto dalle cellule mieloidi che esprimono TNF-β in risposta alla stimolazione da parte del versicano (un proteoglicano della matrice extracellulare, un ligando TLR2, il cui livello è aumentato in molti tipi di cellule tumorali). I nostri studi hanno esaminato anche il ruolo di TLR2 nella progressione del tumore. In particolare, si è scoperto che l'infezione da micoplasma (Mycoplasma arginini) o l'aggiunta di componenti strutturali (LAMB) di questo agente patogeno alle cellule che esprimono TLR2 porta alla soppressione dell'apoptosi in esse, nonché ad un aumento della crescita del tumore in vivo. Pertanto, è stato dimostrato che i TLR possono avere un effetto indiretto di stimolazione del tumore attraverso le cellule mieloidi.

Dati simili sono stati ottenuti per un altro membro della famiglia TLR, TLR4. La somministrazione sistemica (endovenosa) del ligando di questo recettore, LPS, ha stimolato la migrazione delle cellule tumorali (adenocarcinoma mammario) e ne ha aumentato l'invasività, oltre a stimolare l'angiogenesi nei tumori. Risultati simili sono stati ottenuti in un altro modello: l'adenocarcinoma intestinale: l'LPS ha aumentato la sopravvivenza delle cellule tumorali, ne ha stimolato la proliferazione e, quando somministrato per via intraperitoneale, ha aumentato le metastasi. Inoltre, Huang et al. hanno dimostrato che le cellule tumorali che esprimono TLR4 causano un decorso della malattia significativamente più aggressivo (ridotta durata di vita degli animali) rispetto ai topi isogenici in cui TLR4 è inattivato da specifici siRNA. I dati ottenuti suggeriscono che la progressione dei tumori TLR4-positivi può essere influenzata da ligandi endogeni (proteine ​​da shock termico; β-defensine; LPS endogeno rilasciato dall'intestino), il che ricorda in parte la situazione con l'effetto di stimolazione del tumore di TLR2 e il suo ligando di origine endogena - versicano.

Tuttavia, i dati che illustrano l'effetto stimolante il tumore dei TLR sono stati ottenuti non solo per TLR2 e 4. È noto che una maggiore espressione di TLR5 e TLR9 sulle cellule epiteliali cervicali può essere associata alla progressione del cancro cervicale. Alti livelli di espressione di TLR9 sono stati rilevati in campioni clinici di cancro al polmone e in linee cellulari tumorali. In queste cellule, la stimolazione di TLR9 con agonisti specifici ha comportato un aumento della produzione di citochine associate al tumore. I livelli di TLR9 sono elevati anche sulla superficie delle cellule tumorali della prostata umana. Il trattamento di tali cellule con oligodeossinucleotidi CpG (ODN-CpG) o DNA batterico, che fungono da ligandi per TLR9, ha aumentato l’invasione delle cellule tumorali. L’aumento dell’invasione delle cellule tumorali come risultato dell’attivazione di TLR9 può essere considerato un nuovo meccanismo attraverso il quale le infezioni croniche possono stimolare la crescita delle cellule tumorali della prostata.

Tuttavia, non solo i vari agenti infettivi e i loro componenti strutturali hanno la capacità di stimolare la carcinogenesi attraverso l’interazione con i TLR. Come è noto, i DAMP, proteine ​​nucleari e citoplasmatiche delle cellule che hanno subito necrosi, fungono anche da ligandi per i TLR. I DAMP rilasciati dalle cellule danneggiate possono essere riconosciuti da vari TLR sulla superficie delle cellule immunitarie e la successiva attivazione di segnali TLR-dipendenti può portare alla soppressione della risposta immunitaria antitumorale e, di conseguenza, alla stimolazione della progressione del tumore.

Tali molecole con potenziali effetti di promozione del tumore includono: proteine ​​da shock termico (HSP60, 70), ATP e acido urico, la famiglia di proteine ​​modulanti il ​​Ca2+ (S100), proteina HMGB1 e acidi nucleici, di cui la proteina legante il DNA HMGB1 è la proteina più ben studiato. La proteina HMGB1, rilasciata a seguito del danno cellulare, attiva il sistema immunitario attraverso l'interazione con i TLR. Colture cellulari hanno dimostrato che la proteina HMGB1 stimola la crescita delle cellule tumorali del melanoma, della mammella, del colon, del pancreas e della prostata. HMGB1 è in grado di attivare TLR2 e TLR4 sulle cellule tumorali e sulle cellule del sistema immunitario e, di conseguenza, indurre la progressione del tumore e la metastasi.

È stato dimostrato che le cellule di melanoma hanno una maggiore espressione di DAMP come le proteine ​​della famiglia S100, che possono stimolare la crescita sia delle cellule stesse del melanoma che dei linfociti del sangue periferico, agendo come fattore di crescita autocrino del tumore. La proteina S100A4, che funge da ligando per i TLR, stimola la metastasi delle cellule del cancro al seno e la sua maggiore espressione è un indicatore di prognosi sfavorevole. Nonostante l'associazione di S100A4 con metastasi, questa proteina può essere espressa da macrofagi, linfociti e fibroblasti. Studi recenti hanno dimostrato che le proteine ​​S100A8 e S100A9 prodotte dal tumore primario sono in grado di attivare l'amiloide sierica A (SAA) 3 nel tessuto polmonare e creare così le condizioni per la formazione di una nicchia metastatica. SAA3 funge da ligando per TLR4 sulle cellule endoteliali polmonari e sui macrofagi. L'attivazione di TLR4 facilita la migrazione delle cellule tumorali dalla lesione primaria al tessuto polmonare creando un microambiente che promuove la crescita del tumore. Pertanto, la soppressione della via di segnalazione S100-TLR4 può contrastare efficacemente la formazione di metastasi polmonari.

Riassumendo gli effetti descritti, possiamo concludere che i TLR, da un lato, possono partecipare direttamente o indirettamente alla progressione del tumore e, dall'altro, aumentare la resistenza delle cellule tumorali agli effetti proapoptotici.

I dati presentati mostrano che gli effetti di stimolazione del tumore dei TLR e dei loro ligandi hanno un meccanismo complesso che necessita di essere studiato più in dettaglio. Tuttavia, nonostante la complessità questo problema, possiamo evidenziare diversi punti chiave che determinano l'effetto stimolante il tumore dei TLR:

1) l'interazione del TLR con i propri ligandi induce l'attivazione del fattore di trascrizione NF-kB e, di conseguenza, un aumento della produzione di varie citochine proinfiammatorie (IL-6, MCP-1, MIF, GROb, ecc.) .), così come un certo numero di proteine ​​anti-apoptotiche, promuovendo così l'effetto stimolante il tumore diretto o indiretto;

2) L'attivazione TLR-dipendente delle cellule mieloidi e dei loro precursori sembra essere un fattore determinante nella formazione di metastasi. Una serie di studi indipendenti hanno dimostrato che le cellule mieloidi che migrano dal midollo osseo (in risposta alla stimolazione endogena) nei tessuti svolgono un ruolo chiave nella formazione di nicchie metastatiche. Poiché è noto che i ligandi dei TLR endogeni (versicano, fibronectina, ecc.) ed esogeni (di origine microbica) sono in grado, da un lato, di stimolare le cellule mieloidi e i loro precursori, e dall’altro di aumentare il potenziale metastatico del tumore, può essere molto probabile che la relazione tra l'attivazione TLR-dipendente delle cellule mieloidi e il loro successivo coinvolgimento nelle metastasi;

3) L'attivazione dei TLR può stimolare l'angiogenesi attraverso fattori antigenici come IL-8, il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF) e le metalloproteinasi della matrice (MMP), oltre a migliorare le proprietà adesive e invasive delle cellule tumorali insieme all'aumento della permeabilità vascolare.

Pubblicato su Allbest.ru

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2.2. Riconoscimento degli estranei nel sistema immunitario innato

in vivo su animali knockout per i geni TLR (per la scomparsa della capacità di fornire protezione contro alcuni agenti patogeni). Le regioni leganti i TLR hanno un'affinità piuttosto elevata per i ligandi. Queste regioni sono strutture a forma di ferro di cavallo, la cui parte esterna è formata da a-eliche, e la parte interna, che lega il ligando, è formata da p-fogli. I dati sulla specificità e localizzazione dei TLR umani sono mostrati schematicamente in Fig. 2.11.

Molto spesso, i TLR riconoscono strutture contenenti lipidi, oligonucleotidi e carboidrati; meno spesso - proteine ​​(ad esempio flagellina nel caso di TLR-5). La formazione di un complesso avviene quando l'LPS batterico viene riconosciuto dal recettore TLR-4 (vedi Fig. 2.10). Il riconoscimento dell'LPS richiede innanzitutto il suo rilascio dalla parete cellulare batterica, dopodiché forma un complesso con il fattore sierico LBP (complesso legante LPS). LBP ha un'affinità per la molecola di membrana CD14, che garantisce l'interazione del complesso LPS-LBP con essa. Quindi questo complesso (già attaccato alla membrana attraverso il lipide A, che fa parte di LPS) si lega alla superficie interna (idrofobica) della molecola MD2, la sua superficie esterna interagendo con la superficie interna del “ferro di cavallo” TLR-4 (cioè , infatti, TLR-4 riconosce non LPS, ma MD2). Un ruolo simile per le molecole corecettrici è stato identificato nel riconoscimento del pattern TLR-2; in questo caso le molecole CD14, CD36 e l'integrina avP3 (vitronectina) agiscono come corecettori. Sembra che il riconoscimento del pattern TLR richieda la partecipazione di molecole aggiuntive.
Alcuni TLR riconoscono gli acidi nucleici e le strutture simili ai nucleotidi, il che è importante per riconoscere sia virus che batteri. Pertanto, TLR-3 riconosce l'RNA a doppio filamento, caratteristico della maggior parte dei virus, e TLR-9 riconosce sezioni di DNA arricchite in sequenze CpG non metilate (citidina-fosfato-guanosina), caratteristiche del DNA batterico. TLR-7 e TLR-8 hanno un'affinità per i derivati ​​dell'imidazocolina e della guanosina (ad esempio, quando TLR-7 interagisce con essi, viene mobilitata la difesa antivirale). Data la relazione strutturale di questi derivati ​​con il DNA virale, si ritiene che TLR-7 e TLR-8 siano coinvolti nel riconoscimento dell'RNA virale a filamento singolo. Tutti e 4 i tipi di TLR che riconoscono gli acidi nucleici (TLR-3, TLR-7, TLR-8, TLR-9) sono localizzati all'interno della cellula (vedi Fig. 2.11). A causa delle caratteristiche strutturali della regione transmembrana di questi TLR, essi sono presenti solo sulla membrana del reticolo endoplasmatico, ma non sul plasmalemma. Durante l'endocitosi del materiale contenente PAMP, i TLR vengono mobilitati dalla membrana del reticolo alla membrana del fagolisosoma, dove riconoscono i modelli e trasmettono un segnale alla cellula. La localizzazione di TLR-3, TLR-7, TLR-8, TLR-9 non sulla superficie cellulare, ma nel fagolisosoma protegge dal riconoscimento dei propri acidi nucleici, che è irto dello sviluppo di patologie autoimmuni. Il self-DNA o RNA entra nei fagolisosomi solo durante l'apoptosi potenziata. Inoltre, gli acidi nucleici situati all'interno di virus e batteri diventano accessibili ai recettori solo nei fagolisosomi, dove gli agenti patogeni vengono distrutti. L'espressione dei TLR sulle cellule immunitarie innate è descritta nella Tabella. 2.10.
Come risultato del riconoscimento dei ligandi TLR, viene generato un segnale di attivazione. Il dominio TIR intracellulare, così come le molecole adattatrici ad esso associate, svolgono un ruolo decisivo. Il processo di segnalazione dei TLR sarà discusso nel contesto dell'attivazione delle cellule immunitarie innate (vedere sezione 2.2.4).
Tabella 2.10. Espressione dei recettori Toll-like sulle cellule del sistema immunitario

Recettore	Tipi di cellule									Effetto dell'attivazione sull'espressione
	Monociti e macrofagi	Neutrofili	-0 A IO ¦8- O IO IO con DI 0	Mastociti	Dendritico cellule	Naturale assassini	IO IO N F A « 1 C.Q.	IO IO N F A «	Naturale normativo Cellule T
TLR-1	+	+	+	+	+ (M, P)	+	+	+	+	Espressione costitutiva su tutte le cellule
TLR-2	++	++		+	++(M)				+
TLR-3	++/+*	-	-	-	++(M)	++	-	+	-	Nessun guadagno
TLR-4	++	++	+	+	++(M)	+			+	Potenziato da modelli molecolari e citochine associati agli agenti patogeni
TLR-5	++	+	-	-	+(M)	+	+	-	+	Nessun guadagno
TLR-6	++	+	-	+	+(M, P)	+	+	++	+	Stesso
TLR-7	+	+	+	-	+(P)	-	-	+	+	Aumentato dalle citochine
TLR-8	++	+	-	-	+(M)	+	+	-	+	Aumentato da IFNy
TLR-9	+	+	+	-	+(P)	+	-	+	-	Stesso
TLR-10	+	+	+	-	+	-	-	+	-	Nessun guadagno

M - mieloide;
P - plasmocitoide;
* - forte espressione sui monociti, più debole sui macrofagi.

Negli ultimi dieci anni nel campo dell'immunologia fondamentale, in particolare nello studio dei meccanismi dell'immunità innata non specifica, sono state fatte due scoperte eccezionali, che ora sono giustamente considerate la base della resistenza innata alle malattie infettive. In primo luogo, è stato riscontrato (B. Lemaitre et al., 1996) che la proteina Toll della Drosophila, precedentemente nota come strumento essenziale nell'embriogenesi della mosca, svolge un ruolo importante nella resistenza aspecifica, in particolare proteggendola dalle infezioni causate da funghi di il genere Aspergillus. Come risultato di studi successivi, proteine ​​con una funzione simile furono scoperte nei mammiferi, compreso l'uomo, e furono chiamate recettori Toll-like (TLR). In secondo luogo, è stato descritto uno dei primi recettori di questo tipo nei topi (A. Poltorak et al., 1998), TLR4, che gli autori hanno identificato come un recettore per il lipopolisaccaride (LPS), necessario ai topi per un riconoscimento efficace e una risposta immunitaria ai gram- batteri negativi, di cui LPS è parte integrante della membrana cellulare esterna. Questi studi hanno confermato la presenza di un apparato di riconoscimento nelle cellule immunitarie innate non specifiche e hanno indicato il ruolo centrale dei TLR nel riconoscimento primario dei patogeni infettivi nei mammiferi.

La scoperta dei TLR è stata paragonata in termini di importanza alle precedenti scoperte di recettori di riconoscimento nei linfociti B e T. Ma, dato che i meccanismi dell'immunità innata non specifica precedono l'inclusione dei meccanismi dell'immunità specifica acquisita, si ritiene che i TLR siano recettori più importanti nella gerarchia della resistenza immunitaria generale.

È ormai dimostrato che i TLR sono una famiglia di glicoproteine ​​di membrana presenti principalmente su cellule dendritiche, macrofagi e granulociti polimorfonucleati. I TLR fanno parte della superfamiglia delle glicoproteine ​​integrali di membrana di tipo I, che comprende anche i recettori dell'interleuchina-1 (IL-1R). Confrontando questi due recettori, si è scoperto che le loro parti extracellulari differiscono in modo significativo: IL-1R ha tre domini simili a Ig e TLR ha sequenze di aminoacidi ricche di leucina. Al contrario, il dominio citoplasmatico del TLR ha un'elevata omologia con quello dell'IL-1R ed è stato chiamato TIR (recettore Toll-IL-1) (J.L. Slack et al., 2000). In totale, il dominio citoplasmatico è costituito da circa 200 aminoacidi, le cui regioni omologhe costituiscono tre regioni separate (scatole) necessarie per la trasduzione del segnale, cioè per trasmettere un segnale nella cellula.

I TLR delle cellule monociti-macrofagiche e, soprattutto, delle cellule dendritiche, si legano ai loro ligandi e trasmettono un segnale di allarme all'interno della cellula, che porta alla produzione di una serie di citochine proinfiammatorie e di molecole costimolatrici. Di conseguenza, l'infiammazione si sviluppa come reazione protettiva del corpo da parte dell'immunità non specifica e vengono compiuti i primi passi per sviluppare un'immunità specifica (adattativa) (Sh. Akira, K. Takeda, 2004; B. Beulter, 2004).

Recettore cellulare toll-like 9 ( recettore toll-like 9, TLR9) - uno dei rappresentanti della "prima linea" della risposta immunitaria del corpo - lega specificamente il DNA virale e batterico, formando caratteristiche strutture dimeriche a forma di m. L'interazione con il DNA patogeno avviene a causa della presenza di un componente speciale in esso: un motivo dinucleotide citosina-fosfato-guanina (CpG), che si lega selettivamente al recettore in determinati siti. L'istituzione della struttura cristallina del complesso “recettore-motivo” ha aiutato a comprendere meglio le peculiarità del funzionamento di questo componente dell'immunità innata.

Uno studio dettagliato delle caratteristiche di legame del motivo CpG con il recettore ha mostrato che l'attività immunostimolante del dinucleotide dipende da diversi fattori importanti.

Primo e il più ovvio di questi è la quantità di sequenze di citosina-guanina non metilate nel DNA “ostile”. Più motivi CpG sono presenti nella catena nucleotidica di un batterio, maggiore sarà il numero di recettori che lo legheranno.

Secondo la caratteristica identificata è un certo “modello” del motivo, espresso dalla formula R.R. C.G. AA(Dove CON- citosina, G- guanina, e R E Y- eventuali basi puriniche e pirimidiniche rispettivamente). È interessante notare che l'inversione di C e G porta alla formazione solo di un complesso monomerico inattivo TLR9-CpG, mentre la formazione di uno attivo implica dimero a forma di m struttura con un rapporto recettore:ligando di 2:2.

Terzo il fattore è l'elaborazione del recettore, necessaria per la formazione di un dimero stechiometrico. Se non vi era alcuna lavorazione o questa veniva eseguita in modo errato, si formavano praticamente solo forme monomeriche. Il dimero TLR9 non legato è un cosiddetto Z-loop costituito da regioni ricche di leucina ( ripetizione ricca di leucina, LRR) (figura 1).

Gli autori dello studio hanno soprannominato in modo eloquente il meccanismo di legame del motivo CpG al sito recettore “ colla molecolare". Un frammento di DNA a filamento singolo si avvolge attorno al recettore, iniziando dall'N-terminale della molecola proteica e attraversando diversi siti LRR. Si tratta di una catena nucleotidica che può adattarsi perfettamente alle regioni richieste di TLR9: quando si tenta di utilizzare il DNA a doppio filamento negli esperimenti, l'affinità del recettore diminuisce drasticamente.

Il motivo CpG stesso, secondo il modello sopra, presentato sotto forma di esamero, formava un sistema complesso di legami idrogeno con due dozzine di amminoacidi ed era inoltre coordinato dalle interazioni di van der Waals con altri dieci residui. È importante che due molecole di DNA siano soggette a tale “attacco fiancheggiato”, poiché il complesso recettoriale associato esiste nella forma omodimero(Fig. 2). Nonostante l’abbondanza di aminoacidi che legano il motivo CpG, mutazioni di alcuni di essi, anche singolarmente, possono ridurre seriamente l’“adesione” del dinucleotide al recettore.

A cosa può essere utile un’identificazione così approfondita delle caratteristiche operative di TLR9? Naturalmente creando farmaci mirati a stimolare o, al contrario, inibire l'attività di questi recettori. I disturbi nel funzionamento del sistema immunitario (sia nella direzione dell'attivazione che della soppressione) sono alla base di molte malattie infettive e autoimmuni. La conoscenza della struttura e dei meccanismi di funzionamento dei partecipanti al sistema immunitario innato consentirà senza dubbio di regolarli e riportare alla normalità i parametri “bloccati”.