Reagenti per la purificazione e l'isolamento degli acidi nucleici sintolo. Mangimi per animali o materiali vegetali

Il metodo di estrazione rapida del DNA con microcolonna è progettato per l'estrazione del DNA totale da sangue, plasma, saliva, urina, colture cellulari e qualsiasi pellet cellulare nel tampone. L'elevata purezza del DNA isolato ne consente l'utilizzo per tutti i tipi di analisi.

il tempo di isolamento varia da 30 a 45 minuti a seconda del numero di campioni;

• il legame efficace del DNA alla membrana della colonna consente di ottenere la massima resa di DNA dal campione;
• si ottiene un elevato grado di purificazione grazie alla composizione ottimizzata dei componenti delle soluzioni di lisi e di lavaggio;
• frammentazione e perdita di DNA significativamente ridotte durante il lavaggio rispetto ad altri metodi di estrazione con sorbente;
• è possibile concentrare il DNA riducendo il volume della soluzione di eluizione;
• L'estrazione del DNA sulle colonne riduce significativamente il consumo di plastica aggiuntiva;
• volume massimo del campione: 200 µl;
• il kit contiene Proteinasi K;
• la purezza del DNA isolato è 1,8-1,9 secondo il rapporto A260/A280;
• la quantità di DNA estratto dipende dal tipo e dalla quantità di campione. La resa del DNA da 200 µl di sangue è in media di 5-6 µg.

Set di reagenti per l'isolamento del DNA genomico "DNA-Extran"

Utilizzando i kit per l'isolamento del DNA genomico della serie DNA-Extran, è possibile isolare il DNA da una varietà di materiali biologici: sangue, colture di cellule batteriche e animali, tessuti freschi, congelati o essiccati di animali e piante.

• estrazione completa del DNA dalle cellule, riducendo al minimo la perdita e la frammentazione del DNA durante la purificazione;
• ha il DNA isolato alto livello purezza (rapporto A260/A280 = 1,8-1,9) e adatto per PCR, digestione di restrizione, ibridazione e altri studi;
• i kit non contengono componenti potenzialmente pericolosi come fenolo e cloroformio, non richiedono grandi quantità di plastica e non generano rifiuti tossici.

Set di reagenti per l'estrazione del DNA su particelle magnetiche "M-Sorb-Tube"

Adatto per l'isolamento del DNA micobatterico da espettorato, lavaggi bronchiali, liquido cerebrospinale, essudato, punti punteggiati, biopsia, urina, secrezioni del tratto genitale e colture cellulari. La pre-lavorazione del materiale clinico viene effettuata in conformità con le procedure standard per la preparazione dei campioni per studi microbiologici (Ordinanza n. 109 del Ministero della Salute della Federazione Russa del 21 marzo 2003 “Sul miglioramento delle misure antitubercolari nella Federazione Russa ”, Appendice 11 “Istruzioni per i metodi unificati ricerca microbiologica nell’individuazione, diagnosi e cura della tubercolosi”). Per inattivare il materiale clinico, consigliamo di utilizzare la soluzione inattivante A da noi sviluppata.

La soluzione A uccide i micobatteri entro 12 ore e disinfetta il materiale clinico, che può essere utilizzato per ulteriori analisi (estrazione del DNA, PCR, ecc.). La soluzione A è adatta specificamente per il trattamento dell'espettorato e sostituisce completamente la procedura standard utilizzando la soluzione NaOH-NALC e ha eccezionali proprietà mucolizzanti. La soluzione di inattivazione A aumenta la resa del DNA rispetto alla preparazione del campione NaOH-NALC standard.

La tecnica di isolamento comprende: lisi del DNA con isotiocianato di guanidina, assorbimento del DNA su particelle magnetiche, precipitazione del DNA mediante centrifugazione, fasi di lavaggio ed eluizione del DNA. Può essere utilizzato per isolare il DNA da altri microrganismi.

l'uso di particelle magnetiche rivestite di gel di silice come assorbente è un formato tecnologicamente più avanzato e conveniente rispetto ad altri assorbenti e consente la massima standardizzazione e automazione della tecnica di estrazione del DNA;

Un controllo positivo interno (IPC) viene aggiunto a ciascun campione del test; la presenza/assenza di inibitori della RT-PCR e l'efficienza dell'estrazione del DNA vengono determinate dalla reazione di amplificazione dell'IPC.

Kit di reagenti per l'estrazione del DNA da prodotti alimentari e materie prime alimentari

I kit di reagenti “Sorb-GMO-A” e “Sorb-GMO-B” sono progettati specificamente per l'estrazione del DNA da materiali vegetali, prodotti alimentari e nutrire. Entrambi i kit utilizzano un assorbente al silicio per la purificazione del DNA. “Sorb-GMO-A” contiene cloruro di guanidina come agente di lisi, “Sorb-GMO-B” è un detergente ionico CTAB, che fornisce la massima resa di DNA dai componenti vegetali. Caratteristiche distintive I vantaggi del kit Sorb-GMO-A sono la velocità di estrazione del DNA e l'assenza di cloroformio, che rende più sicuro il lavoro con il kit.

Set di reagenti per l'estrazione del DNA da campioni di acqua (su particelle magnetiche) "M-Sorb-Leg"

Progettato per l'isolamento del DNA della Legionella da corpi idrici ambiente(torri di raffreddamento, piscine, parchi acquatici, sistemi di fornitura di acqua calda e fredda). La concentrazione minima isolata di Legionella è di 100 cellule per 0,5 litri di campione.

Il kit “M-Sorb-Leg” è prodotto in due modifiche: “M-Sorb-Leg1000” per campioni di acqua con un volume di 1-1000 ml e “M-Sorb-Leg1” per campioni di acqua con un volume fino a 1 ml. Il set M-Sorb-Leg1000 fornisce la filtrazione dell'acqua utilizzando un filtro in policarbonato.

il set di reagenti M-Sorb-Leg consente di eliminare gli inibitori della PCR presenti nei campioni di acqua fortemente contaminati;

• La tecnica di isolamento del DNA si basa sull'assorbimento del DNA su particelle magnetiche rivestite di gel di silice seguito dalla precipitazione con un reagente precipitante. Combina i vantaggi dei metodi di assorbimento e del metodo di precipitazione totale;
• Un controllo positivo interno (IPC) viene aggiunto a ciascun campione del test; la presenza/assenza di inibitori della RT-PCR viene determinata dalla reazione di amplificazione dell'IPC.

Set di reagenti per l'estrazione del DNA da oggetti ambientali (su particelle magnetiche) "M-Sorb-OOM"

Il set di reagenti M-Sorb-OOM è destinato all'isolamento del DNA da oggetti ambientali (suolo, acqua, cadaveri di animali, ecc.) sospettati di essere infetti da microrganismi particolarmente pericolosi (DOM), al fine di prepararli per la successiva analisi mediante RT-PCR. La procedura di isolamento è simile a quella descritta per il kit M-Sorb-Leg.

Set di reagenti per l'isolamento dell'RNA "RNA-Extran"

Il kit è destinato all'isolamento dell'RNA da sangue, frammenti di tessuto e colture cellulari. L'RNA ottenuto utilizzando il kit RNA-Extran può essere utilizzato sia per RT-PCR che per analisi di ibridazione, traduzione in vitro e clonazione.

Il principio dell'isolamento dell'RNA si basa sull'estrazione fenolica acida secondo Khomchinsky, in cui solo l'RNA rimane nella fase acquosa e il DNA in complesso con le proteine ​​passa nella fase organica. Il tiocianato di guanidina è utilizzato come agente isolante e denaturante per le nucleasi cellulari.

permette di ottenere RNA altamente purificato, esente da impurità del DNA;

fornisce l'estrazione completa dell'RNA da sangue intero, frammenti di tessuto e colture cellulari;

permette di ottenere RNA integro;

• Tempo di isolamento dell'RNA - 1 ora.

numero di catalogo	Nome	numero di reazioni
EX-509	Set di reagenti “DNA-Extran-1” per l'isolamento del DNA genomico da sangue intero	100
EX-511	Set di reagenti “DNA-Extran-2” per l'estrazione del DNA da tessuti animali e umani	100
EX-512	Set di reagenti “DNA-Extran-3” per l'estrazione del DNA da colture batteriche	100
EX-513	Set di reagenti “DNA-Extran-4” per l'estrazione del DNA da tessuti vegetali	100
EX-514	Set di reagenti “K-Sorb” per l'isolamento del DNA totale su colonne (da sangue, saliva, urina, colture cellulari, raschiamenti di cellule epiteliali)	100
EX-515	Set di reagenti "RNA-Extran" per isolare RNA da sangue, tessuti, colture cellulari	50
OM-505	Set di reagenti “M-Sorb-Tub” per l'estrazione del DNA da campioni clinici e colture cellulari (su particelle magnetiche)	50 o 100
GM-502-50	“SORB-GMO-A” (guanidina + assorbente) Set di reagenti per l'estrazione del DNA da materiali vegetali e prodotti alimentari	50
GM-503-50	“SORB-GMO-B” (CTAB+sorbente) Set di reagenti per l'estrazione del DNA da materiali vegetali e prodotti alimentari	50
OM-506	Set di reagenti “M-Sorb-Leg1000” per l'isolamento del DNA della Legionella da campioni di acqua fino a 1000 ml (sulle particelle magnetiche i filtri sono forniti separatamente)	50 o 100
OM-507	Set di reagenti “M-Sorb-Leg1” per l'isolamento del DNA della Legionella da campioni di acqua fino a 1 ml di volume (su particelle magnetiche)	50 o 100
OOM-502	Set di reagenti “M-sorb-OOM” per l'estrazione del DNA da oggetti ambientali (su particelle magnetiche)	50 o 100

Informazioni sull'ordinazione

Nome	Volume	Produzione	Metodo	Cat.No.
“GMO-MagnoSorb” (guanidina + assorbente magnetico) Set di reagenti per l'estrazione del DNA da materiali vegetali e prodotti alimentari	50 assegnazioni	Sintolo	PCR in tempo reale	GM-505-50
“SORB-GMO-A” (guanidina + assorbente) Set di reagenti per l'estrazione del DNA da materiali vegetali e prodotti alimentari	50	Sintolo	PCR in tempo reale	GM-502-50-50
“SORB-GMO-B” (CTAB+sorbente) Set di reagenti per l'estrazione del DNA da materiali vegetali e prodotti alimentari	50	Sintolo	PCR in tempo reale	GM-503-50-50
Set di reagenti Kit “Amplitub-RV” n. 1 (“M-Sorb-Tub”) per l'isolamento del DNA micobatterico da campioni clinici e cellule di coltura (su particelle magnetiche)	50	Sintolo	PCR in tempo reale	OM-505
Set di reagenti “DNA-Extran-1” per l'isolamento del DNA genomico da sangue intero	100	Sintolo	PCR in tempo reale	EX-509-100
Set di reagenti “DNA-Extran-2” per l'estrazione del DNA da tessuti animali e umani	100	Sintolo	PCR in tempo reale	EX-511
Set di reagenti “DNA-Extran-3” per l'estrazione del DNA da colture batteriche	100	Sintolo	PCR in tempo reale	EX-512-100
Set di reagenti “DNA-Extran-3” per l'estrazione del DNA da tessuti vegetali	100	Sintolo	PCR in tempo reale	EX-513-100
Set di reagenti “K-Sorb” per l'isolamento del DNA totale su colonne (da sangue, saliva, urina, colture cellulari, raschiamenti di cellule epiteliali)	100	Sintolo	PCR in tempo reale	EX-514-100
	48 reazioni	Sintolo	PCR in tempo reale	GM-443-48
Set di reagenti “screening Soia / 35S+FMV / NOS”	50 reazioni	Sintolo	PCR in tempo reale	GM-416-50

"DNA-sorb-S-M" ® AmpliSens FBUN Istituto Centrale di Ricerca di Epidemiologia di Rospotrebnadzor, Solo per la ricerca Federazione Russa, 111123 e altri scopi non medici, Mosca, ... "

ISTRUZIONI

sull'uso del kit di reagenti

per l’estrazione del DNA da materiale biologico

"DNA-sorb-S-M"

AmpliSense

Istituto centrale di ricerca epidemiologica FBUN

Rospotrebnadzor,

Solo a scopo di ricerca

Federazione Russa, 111123,

e altri scopi non medici

Città di Mosca, via Novogireevskaya, edificio 3A

ELENCO DELLE ABBREVIAZIONI

SCOPO

PRINCIPIO DEL METODO

FORME DI COMPLETAMENTO

ESTRAZIONE DEL DNA DA MATERIALE BIOLOGICO DA ANIMALI................ 8

MATERIE PRIME ALIMENTARI O VEGETALI

SIMBOLI UTILIZZATI NEI PRODOTTI STAMPATI

Modulo 1: RIF K1-6-50-Mod / VER 27/12/16 / pagina 2 di 15

ELENCO DELLE ABBREVIAZIONI

IN di questa istruzione Vengono utilizzate le seguenti abbreviazioni e designazioni:

DNA – acido desossiribonucleico NA – acidi nucleici OK – controllo di estrazione negativo NCO – campione di controllo negativo PC – controllo di estrazione positivo PKO – campione di controllo positivo PCR – reazione a catena della polimerasi

– Federale istituzione di bilancio scienza

Istituto centrale di ricerca FBUN

"Istituto centrale di ricerca di epidemiologia epidemiologica" del Servizio federale di sorveglianza nel campo di Rospotrebnadzor per la protezione dei diritti dei consumatori e del benessere umano

SCOPO

Il kit di reagenti DNA-sorb-S-M è destinato all'estrazione del DNA da materiale biologico di animali: materiale tissutale (biopsia (pelle e mucose del sistema genito-urinario, tratto gastrointestinale, bronchi), materiale chirurgico e autoptico); ed estrazione del DNA da alimenti, additivi biologici, mangimi per animali o materiali vegetali per la successiva ricerca utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR).

L'estrazione del DNA è una procedura preanalitica del metodo PCR.

Volume del campione da analizzare per l'estrazione: 100 µl (sono ammessi campioni con un volume compreso tra 10 e 100 µl o con un peso compreso tra 10 e 100 mg)1.

ATTENZIONE! Per informazioni sulla procedura di raccolta, condizioni per il trasporto e la conservazione del materiale del test, la necessità e la procedura per la sua preparazione per l'estrazione del DNA, nonché informazioni sulle sostanze interferenti e sulle restrizioni associate al campione, consultare le istruzioni per il set di reagenti utilizzato per l'amplificazione.

PRINCIPIO DEL METODO

Il campione del test2 viene trattato con una soluzione di lisi contenente proteinasi K, con conseguente distruzione delle membrane cellulari e rilascio di NK e componenti cellulari. Gli NC disciolti si legano alle particelle del sorbente, mentre gli altri componenti del materiale di prova lisato rimangono in soluzione e vengono rimossi durante la precipitazione del sorbente. A seconda del materiale da testare, consultare le istruzioni del kit di reagenti di amplificazione utilizzato.

Alcuni tipi di materiale biologico richiedono una fase di preparazione del campione. Cm.

istruzioni per il kit di reagenti utilizzato per l'amplificazione.

Modulo 1: RIF K1-6-50-Mod / VER 27/12/16 / pagina 3 di 15 mediante centrifugazione e successivo lavaggio del sorbente. Quando un tampone di eluizione viene aggiunto al sorbente, il NC passa dalla superficie della silice nella soluzione, che viene separata dalle particelle del sorbente mediante centrifugazione. Come risultato di questa procedura, si ottiene una preparazione di NA altamente purificata, priva di inibitori della reazione di amplificazione, che garantisce un'elevata sensibilità analitica dello studio PCR.

FORME DI COMPLETAMENTO

Il kit reagenti è disponibile in 2 configurazioni:

Il Modulo 1 include un set di reagenti “DNA-sorb-S-M” versione 50.

Il Modulo 2 include un set di reagenti “DNA-sorb-S-M” versione 100.

PRECAUZIONI E INFORMAZIONI PER LO SMALTIMENTO

Quando si studia materiale biologico proveniente da animali, il lavoro deve essere svolto in conformità con le regole del Ministero dell'Agricoltura e della Produzione della Federazione Russa del 27 gennaio 1997 n. 13-7-2/840 “Regole per l'esecuzione del lavoro in laboratori diagnostici utilizzando il metodo della reazione a catena della polimerasi. Disposizioni fondamentali”, approvato dal Dipartimento di Medicina Veterinaria.

Durante la ricerca su prodotti alimentari, additivi biologici, mangimi per animali o materiali vegetali, il lavoro deve essere svolto nel rispetto dei requisiti indicazioni metodologiche MU 1.3.2569-09 "Organizzazione del lavoro dei laboratori che utilizzano metodi di amplificazione dell'acido nucleico quando si lavora con materiale contenente microrganismi dei gruppi di patogenicità I-IV" e GOST R 53214-2008 "Prodotti alimentari. Metodi analitici per la rilevazione di organismi geneticamente modificati e di prodotti da essi derivati.

Requisiti generali e definizioni."

Durante il lavoro è necessario rispettare sempre i seguenti requisiti:

– Il processo di laboratorio dovrebbe essere unidirezionale. L'analisi viene effettuata in stanze separate(zone). Il lavoro dovrebbe iniziare nella zona di estrazione e continuare nella zona di amplificazione e rilevamento. Non restituire campioni, apparecchiature o reagenti nell'area in cui è stata eseguita la fase precedente del processo.

– Reagenti non utilizzati, reagenti scaduti, nonché Modulo 1: RIF K1-6-50-Mod / VER 27/12/16 / pagina 4 di 15 reagenti usati, imballaggi3, materiale biologico, compresi materiali, strumenti e articoli materiale biologico contaminato , devono essere smaltiti in conformità con i requisiti di SanPiN 2.1.7.2790-10 “Requisiti sanitari ed epidemiologici per la gestione dei rifiuti sanitari”.

– Utilizzare e sostituire i puntali monouso per pipette con filtro automatico ad ogni operazione4. Gli utensili monouso in plastica devono essere smaltiti in un apposito contenitore contenente un disinfettante utilizzabile per la disinfezione rifiuti sanitari.

– Piatti (mortai e pestelli) e strumenti metallici (bisturi, forbici, pinzette, accessori per frullatori, ecc.) utilizzati per la preparazione dei campioni sono conservati in una soluzione disinfettante (ad esempio, soluzione allo 0,2% di sale sodico dell'acido dicloroisocianurico) per un'ora, lavati con acqua di rubinetto con detergenti tensioattivi e, dopo lavaggio in acqua corrente e deionizzata, essiccati in forno a calore secco per 4 ore alla temperatura di 180 C.

– Il kit di reagenti è destinato all'uso monouso per eseguire lo studio del numero specificato di campioni (vedere la sezione “Composizione”).

– Il kit di reagenti è pronto per l'uso secondo queste istruzioni.

Utilizzare il kit di reagenti esclusivamente per lo scopo previsto.

– Non utilizzare il kit di reagenti se la confezione interna è danneggiata o aspetto Il reagente non corrisponde alla descrizione.

– Non utilizzare il kit di reagenti se non vengono seguite le condizioni di trasporto e conservazione secondo le istruzioni.

I reagenti non utilizzati, i reagenti scaduti, i reagenti usati e gli imballaggi appartengono alla classe di pericolo dei rifiuti sanitari G.

I puntali monouso senza filtro vengono utilizzati per rimuovere il surnatante durante il processo di estrazione utilizzando un aspiratore a vuoto.

Modulo 1: RIF K1-6-50-Mod / VER 27/12/16 / pagina 5 di 15

– Non utilizzare il kit di reagenti dopo la data di scadenza.

– Utilizzare guanti monouso senza polvere, camici da laboratorio e protezioni per gli occhi quando si lavora con campioni e reagenti. Lavarsi accuratamente le mani dopo aver terminato il lavoro. Tutte le operazioni vengono eseguite esclusivamente con guanti per evitare il contatto con il corpo umano.

– Evitare l'inalazione dei vapori, il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose, non ingerire. In caso di contatto, sciacquare immediatamente la zona interessata con acqua e, se necessario, consultare un medico. cure mediche.

– Le schede dati di sicurezza dei reagenti (SDS – scheda dati di sicurezza) sono disponibili su richiesta.

Valutazione dei probabili eventi che potrebbero comportare conseguenze negative per il corpo umano:

Se utilizzato come previsto e rispettando le precauzioni sopra indicate, è escluso il contatto con il corpo umano.

In situazioni di emergenza è possibile:

– irritazione della mucosa degli occhi in persone sensibili,

– irritazione della pelle in persone sensibili,

– reazione allergica,

– dannoso se inalato,

- Nocivo se assunto per via orale.

Effetti specifici del kit di reagenti sul corpo umano:

– Non c’è alcun effetto cancerogeno.

– Non vi è alcun effetto mutageno.

– Nessuna tossicità riproduttiva.

MATERIALI E ATTREZZATURE AGGIUNTIVE

(indicando produttori/fornitori):

1. Provette monouso a vite o a chiusura ermetica in polipropilene da 1,5 e 5,0 ml (ad es. Axygen, Inc.

("Exigen, Inc"), USA, o simili).

2. Puntali monouso per pipette a volume variabile con filtro fino a 200 e fino a 1000 µl (ad esempio Axygen, Inc., USA o simili).

3. Puntali monouso per pipette a volume variabile fino a 200 µl (ad esempio, Axygen, Inc., USA o simili).

Modulo 1: RIF K1-6-50-Mod / VER 27/12/16 / pagina 6 di 15

4. Rack per provette da 1,5 ml (ad esempio Axygen, Inc., USA o simili).

5. Cappa a flusso laminare, classe di sicurezza biologica II tipo A (ad esempio, “BAVp-01-“Laminar-S”-1,2”, JSC “Laminar Systems”, Russia, o simili).

6. Termostato per provette Eppendorf da 25 a 100 °C (ad esempio SIA Biosan, Lettonia, o simili).

7. Agitatore termostatico per provette Eppendorf da 25 a 100 °C (ad esempio TS-100, SIA Biosan, Lettonia o simili).

8. Microcentrifuga per provette Eppendorf con velocità massima centrifugazione di almeno 12 mila g (ad esempio MiniSpin, Eppendorf (Eppendorf Manufacturing Corporation), Manufacturing Corporation Germany o simili).

9. Vortex (ad esempio SIA Biosan, Lettonia, o simili).

10. Aspiratore medico a vuoto con un pallone di trappola per la rimozione del liquido surnatante (ad esempio, "OM-1", LLC "Utes", Russia o simili).

11.Distributori automatici a volume variabile (ad esempio Biohit LLC, Russia o simili).

12. Frigorifero da 2 a 8°C congelatore da meno 24 a meno 16 C.

13.Accappatoio, cappelli, scarpe e guanti monouso separati secondo MU 1.3.2569-09.

14. Contenitori monouso in plastica per lo smaltimento e l'inattivazione dei materiali.

–  –  –

ESTRAZIONE DEL DNA DA MATERIALE BIOLOGICO DA ANIMALI

2. Seleziona quantità richiesta Provette monouso in polipropilene da 1,5 ml con tappi a vite o a chiusura ermetica (compresi i controlli di estrazione negativi e positivi, se forniti per il test PCR).

Quando si conserva il tampone del reagente di lisi e la soluzione di lavaggio 1 a temperature comprese tra 2 e 8 C, è possibile la formazione di un precipitato sotto forma di cristalli.

Modulo 1: RIF K1-6-50-Mod / VER 27/12/16 / pagina 8 di 15

3. Aggiungere 10 µl di BKO6 a ciascuna provetta (se fornita per la ricerca PCR). Aggiungere 400 µl di tampone del reagente di lisi e 17 µl di reagente di lisi alle provette.

4. Aggiungere 100 µl dei campioni del test6 alle provette preparate, utilizzando un puntale separato con un filtro per ciascun campione.

ATTENZIONE! 400 µl di tampone per reagente di lisi e 17 µl di reagente di lisi possono essere aggiunti in una provetta con la quantità richiesta del campione da testare e lì possono essere aggiunti 10 µl di BKO7 (se previsto per la ricerca PCR), utilizzando puntali separati con un filtro.

5. Aggiungere 100 μl di NCO alla provetta di estrazione del controllo negativo (NC), aggiungere 90 μl di NKO e 10 μl di PCO alla provetta di estrazione del controllo positivo (PC) (se sono forniti controlli di estrazione per gli studi PCR).6

6. Chiudere bene i coperchi, mescolare accuratamente e agitare le gocce.

Porre le provette in un termostato con una temperatura di 64 °C per 1 ora, mescolando periodicamente mediante vortex (5 volte ogni 10–12 minuti). L'incubazione è consentita per 12 ore ad una temperatura di 60 °C.

7. Pellet di particelle di campione non disciolte mediante centrifugazione per 5 minuti a 10 mila g (ad esempio, 12 mila giri al minuto per una microcentrifuga MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

8. Prelevare il liquido surnatante in un volume di 200–350 µl con molta attenzione (evitando particelle sospese e goccioline di grasso) utilizzando puntali separati con filtri e trasferirlo in nuove provette. Sedimentare le gocce vortexando.

9. Risospendere l'assorbente universale, agitando vigorosamente utilizzando un vortex. Aggiungere 25 µl di assorbente universale risospeso a ciascuna provetta con un puntale separato e chiudere bene i coperchi.

Mescolare al vortex, lasciare in una griglia per 10 minuti, mescolando ogni 2 minuti.

È possibile modificare il volume dei campioni di test e di controllo; vedere le istruzioni del set di reagenti utilizzato per l'amplificazione.

Modulo 1: RIF K1-6-50-Mod / VER 27/12/16 / pagina 9 di 15

18.Ripetere la procedura di lavaggio dei paragrafi successivi. 15–16, rimuovere completamente il surnatante.

19. Mettere le provette con i coperchi aperti in un termostato a 64 °C per 5–10 minuti per asciugare l'assorbente universale.

20.Aggiungere 50–100 μl di tampone di eluizione B nelle provette (vedere le istruzioni per il kit di reagenti di amplificazione utilizzato).

Miscelare mediante vortex finché l'assorbente non è completamente risospeso. Porre in un termostato a 64 °C per 5–10 minuti, mescolando periodicamente (una volta al minuto) utilizzando un vortice.

Il DNA purificato può essere conservato a una temperatura compresa tra 2 e 8 °C per una settimana, a una temperatura compresa tra meno 24 e meno 16 °C per 6 mesi e a una temperatura non superiore a meno 68 °C per un anno. Per fare ciò è necessario, senza catturare l'assorbente, trasferire il liquido surnatante in una nuova provetta.

Modulo 1: RIF K1-6-50-Mod / VER 27/12/16 / pagina 10 di 15

ESTRAZIONE DEL DNA DA ALIMENTI, ADDITIVI BIOLOGICI,

MATERIE PRIME ALIMENTARI O VEGETALI

ATTENZIONE! Per la procedura di preparazione del materiale biologico per l'estrazione del DNA e il volume del campione da analizzare, consultare le istruzioni del kit di reagenti di amplificazione utilizzato.

1. Riscaldare il tampone del reagente di lisi e la soluzione di lavaggio 1, se conservati a una temperatura compresa tra 2 e 8 °C, a una temperatura di 64 °C fino alla completa dissoluzione dei cristalli.

2. Posizionare le provette da 1,5 ml con i campioni di test pre-elaborati in un rack (per volume/quantità del campione, vedere le istruzioni del kit di reagenti di amplificazione utilizzato).

3. Preparare una provetta monouso in polipropilene da 1,5 ml con un tappo a vite o a chiusura ermetica per il controllo di estrazione negativo (EC). Aggiungere 100 µl di OKO nella provetta.

4. Aggiungere 400 µl di tampone per reagente di lisi e 17 µl di reagente di lisi alle provette con campioni di test e TC.

5. Chiudere bene i coperchi, mescolare accuratamente e agitare le gocce.

Collocare le provette in un termostato con una temperatura di 64 °C per 1 ora, mescolando periodicamente mediante vortex (5 volte ogni 10–12 minuti) oppure utilizzare un termostato agitatore.

6. Pellet di particelle di campione non disciolte mediante centrifugazione per 5 minuti a 10 mila g (ad esempio, 12 mila giri al minuto per una microcentrifuga MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

7. Selezionare il numero richiesto di nuove provette monouso in polipropilene da 1,5 ml con tappi a vite o a chiusura ermetica.

8. Risospendere l'assorbente universale, agitando vigorosamente utilizzando un vortex. Aggiungere 25 µl di assorbente universale risospeso a ciascuna provetta con un puntale separato e chiudere bene i coperchi.

9. Dalle provette con i campioni lisati, prelevare il liquido surnatante in un volume di 200–350 µl con molta attenzione (evitando l'ingresso di particelle sospese e gocce di grasso) utilizzando puntali separati con filtri e trasferirlo in provette con un assorbente. Mescolare al vortex, lasciare in una griglia per 10 minuti, mescolando ogni 2 minuti.

Modulo 1: RIF K1-6-50-Mod / VER 27/12/16 / pagina 11 di 15

10.Centrifugare le provette in una microcentrifuga per 1 minuto a 2mila g (ad esempio, 5mila giri al minuto per una microcentrifuga MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

11. Senza catturare l'assorbente, rimuovere il liquido surnatante da ciascuna provetta con un puntale separato senza filtro da 200 µl, utilizzando un aspiratore a vuoto.

12.Aggiungere 300 μl di soluzione di lavaggio 1 alle provette, chiudere bene i coperchi e agitare nel vortex finché l'assorbente universale non è completamente risospeso.

13.Centrifugare le provette in una microcentrifuga per 1 minuto a 2mila g.

14. Senza catturare l'assorbente, rimuovere il liquido surnatante da ciascuna provetta con un puntale separato da 200 µl senza filtro, utilizzando un aspiratore a vuoto.

15.Aggiungere 500 μl di soluzione di lavaggio 2 alle provette, chiudere bene i coperchi e agitare su vortex finché l'assorbente universale non è completamente risospeso

16.Centrifugare le provette in una microcentrifuga per 1 minuto a 7mila g (ad esempio, 10mila giri al minuto per una microcentrifuga MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

17. Senza catturare l'assorbente, rimuovere il liquido surnatante da ciascuna provetta con un puntale separato da 200 µl senza filtro, utilizzando un aspiratore a vuoto.

18.Ripetere la procedura di lavaggio dei paragrafi successivi. 15-16, rimuovere completamente il surnatante.

19. Mettere le provette con i coperchi aperti in un termostato con una temperatura di 64 °C per 5-10 minuti per asciugare l'assorbente universale.

20.Aggiungere 50 µl di tampone di eluizione B alle provette. Mescolare mediante vortex fino alla completa risospesione dell'assorbente. Porre in un termostato a 64 °C per 5–10 minuti, mescolando periodicamente (una volta al minuto) utilizzando un vortice.

21.Centrifugare le provette in una microcentrifuga per 1 minuto a 10mila g. Il surnatante contiene DNA purificato. I campioni sono pronti per la PCR.

Il DNA purificato può essere conservato a una temperatura compresa tra 2 e 8 °C per una settimana, a una temperatura compresa tra meno 24 e meno 16 °C per 6 mesi e a una temperatura Forma 1: REF K1-6-50-Mod / VER 12 /27/16 / pagina 12 di 15 tutto l'anno non superiore a meno 68 °C. Per fare ciò è necessario, senza catturare l'assorbente, trasferire il liquido surnatante in una nuova provetta.

DURATA, CONDIZIONI DI TRASPORTO E STOCCAGGIO.

Data di scadenza. 12 mesi I kit di reagenti scaduti non possono essere utilizzati. La data di scadenza dei reagenti aperti corrisponde alla data di scadenza indicata sulle etichette dei reagenti non aperti, salvo diversa indicazione nelle istruzioni.

Trasporti. Il kit di reagenti deve essere trasportato a una temperatura compresa tra 2 e 8 C per non più di 5 giorni in contenitori termici contenenti elementi freddi, tutti i tipi di contenitori coperti veicoli. Al ricevimento, smontare in conformità con le temperature di conservazione specificate.

Magazzinaggio. Conservare il kit di reagenti a una temperatura compresa tra 2 e 25 C, ad eccezione del reagente di lisi. Conservare il reagente di lisi in frigorifero a una temperatura compresa tra 2 e 8 C.

Le camere di refrigerazione devono fornire condizioni di temperatura regolate.

Soluzione di lisi 30 cm 3,

Soluzione di lavaggio 1 30 cm 3,

Concentrato per soluzione detergente 2 20 cm 3,

Sospensione assorbente 2 cm 3,

Tampone di eluizione del DNA 4 cm 3 .

Procedura operativa:

Preparare la soluzione detergente 2 mescolando 20 cm 3 del concentrato del kit, 80 cm 3 di acqua distillata e 100 cm 3 di etanolo al 96% in una bottiglia separata. Conservare la soluzione presso temperatura ambiente

in una bottiglia ben avvitata.

Controllare le condizioni dell'assorbente: quando si deposita, dovrebbe occupare circa la metà del volume della sospensione.

In una provetta di polipropilene da 1,5 cm 3 ben chiusa (preferibilmente con tappo a vite), aggiungere 100 µl di un campione di test pre-preparato, campione negativo o positivo, aggiungere 300 µl di soluzione di lisi (a ciascun campione con una punta separata) e mescolare accuratamente pipettando 3-10 volte.

Aggiungere 15 - 20 µl di assorbente risospeso, mescolare bene mediante vortex, posizionare su un treppiede per 5-7 minuti per la completa sedimentazione dell'assorbente.

Aggiungere 300 μl di soluzione di lavaggio 1, agitare fino a risospendere completamente l'assorbente (se l'assorbente si decompone fortemente, disgregarlo con una pipetta), sedimentare in una centrifuga a 4-8 mila giri al minuto per 30 secondi. Raccogliere il surnatante da ciascuna provetta utilizzando un puntale separato.

Aggiungere 800 μl di soluzione di lavaggio 2, agitare su vortex finché l'assorbente non è completamente risospeso, sedimentare in una microcentrifuga a 6-10 mila giri al minuto per 30 secondi e raccogliere il surnatante.

Ripetere il passaggio 6, selezionare attentamente il surnatante, asciugare il sedimento assorbente in un termostato a 65 °C per 5 minuti.

Risospendere l'assorbente in 30-40 μl di tampone di eluizione, porre in un termostato a 65°C per 5 minuti, agitando periodicamente mediante vortex.

Sedimento in una microcentrifuga a velocità massima 1 minuto

Il campione è pronto per la PCR; il surnatante contiene DNA purificato.

Come controllo negativo durante la fase di estrazione del DNA, è necessario utilizzare acqua salina o deionizzata.

L’efficienza dell’estrazione del DNA utilizzando il kit DNA-sorb-PCR è del 30 – 60%.

Materiale clinico	Plasma, siero	Raschiamento, sperma, lavaggi faringei, urina	Biopsia, sangue, feci
Numero di pipettamenti
Volume assorbente
Tasso di deposizione del sorbente	8mila giri	6mila giri al minuto	3-4 mila giri
Volume dell'eluente
Efficienza di estrazione del DNA

5.2. Fase 2. Impostazione della composizione PCR del kit per l'amplificazione PCR:

5x tampone di reazione 1000 µl (soluzione blu viscosa e trasparente)

Acqua deionizzata.2000 µl

Miscela di nucleotidi.500 µl

Taq polimerasi.100 µl

Miscela di primer.500 µl

Cera per PCR.2000 µl

Controllo positivo: 100 µl

Controllo negativo 100 µl

Olio minerale 4000 µl

Il kit viene conservato a meno 20°C per un anno.